EC降解酶的乙醇耐受性在酒精饮料的应用中非常重要。从图6可以看出,甲酸降解究随着乙醇体积分数的乙酯升高,游离酶和固定化EC降解酶酶活均随之下降,固定但固定化EC降解酶对乙醇表现出良好的化研耐受性。在乙醇体积分数为7%~25%时,氨基同定化EC降解酶酶活均能保留50%以上.同游离酶的甲酸降解究乙醇耐受性相比,变化有一定差异,乙酯初步推测此固定化方法对其乙醇耐受性和酶活提高有一定影响。固定说明此固定化EC降解酶与游离酶相比,化研在乙醇体积分数相对较低时可以保持相对较高的氨基酶活,适用于乙醇体积分数相对较低的甲酸降解究发酵酒精饮料。
如图7所示,在模拟酒样对固定化EC降解酶进行重复性实验,固定结果显示,化研每次使用后酶活均有下降。当重复使用8次以后,固定化EC降解酶酶活力保留在50%以上,因此在8次前使用效果较好。
此结果与文献报道的GO-CS复合同定酸性酶使用10次时的酶活80%相比,可使用次数稍显劣势圈,但就所得固定化酶而言,仍然可以考虑将使用次数尽量控制在8次以内以获得更好的效果。
固定化EC降解酶在不同储存温度随贮藏时问的酶活变化如图8所示。在4℃条件下,酶活随时问逐渐降低,酶活降低速率在1~3周和4~6周的变化都较平稳,而在3~4周的变化最大:且贮藏6周之内,酶活损失不足30%。在20℃条件下,酶活随时间延长逐渐降低,至第5周时基本保持不变,但在贮藏6周之后,酶活仅达到60%。说明贮藏温度对同定化EC降解酶的酶活有一定影响,但不是唯一因素。因此在该实验条件下,尽量将固定化酶保藏在4~20℃,但基于固定化酶最适反应温度和出于经济节约方面的考虑,以20℃作为最佳贮藏温度条件。
如图9所示,随着静置时间增加,游离酶和固定化EC降解酶酶活均呈现下降趋势,但存整个过程中,固定化酶酶活均高于游离酶酶活。当静置96h时,固定化酶酶活与游离酶酶活相差最大,相较于起初酶活差异,后期的差异更大,可能是南于相同酶量的条件下,起初游离酶更容易与底物接触,而随着时间推移,固定化酶由于载体的保护作用,仍能慢慢显示出较高的酶活性。静置144h之前,固定化酶酶活的损失率在50%以下,说明此酶可以适应“美乐”葡萄酒的微环境,用于葡萄酒中EC的去除。
“美乐"葡萄酒样品中添加等量酶活的固定化EC降解酶和游离酶一段时间后,样品中EC质量浓度逐渐降低。
从图10可以看出,样品中加酶处理后,处理组的EC质量浓度均低于对照组,处理组的EC去除率高于对照组,说明无论是游离还是固定化EC降解酶的处理,均使“美乐”葡萄酒中EC质量浓度得到了降低,但游离酶酶法去除EC的效果要优于固定化酶处理法。在该实验条件下,固定化EC降解酶对“美乐”葡萄酒中EC的去除率可达30.90%,是游离酶的81.53%。
葡萄酒的风味不是独立存在的,而是由醇、酯、酸、醛、酮、萜类化合物和C13-萜烯类化合物相互协调而产生的,它们共同构成了葡萄酒香气的组成成分。对“美乐”葡萄酒中香气化合物及其相对含量进行了定性和定量分析。
对照组和处理组的葡萄酒中挥发性风味物质的相对含量如表1所示,在3种处理方式下的葡萄酒巾,共检测到29种香气成分,包括12种酯类、9种醇类、3种有机酸和5种醛、酮、酚类。经分析可知,不同处理组中各挥发性物质的相对含量之间无显著差异,但是相较于对照组,处理组的物质种类均有所减少,其中固定化酶处理组减少了8种物质,而游离酶处理组减少了12种物质。说明酶处理对葡萄酒巾挥发性物质的种类数量有些许影响,但对化合物的相对含量影响不显著,而且,固定化酶处理方式对葡萄酒更加友好。相比对照组.酶处理组中的物质均出现了数量的减少,但消失的物质并不相同,固定化酶处理组减少的物质包括:香茅醇、正癸醛、己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸己酯、乙酸苯乙酯和异丙醇。而游离酶处理组减少的物质分别是香茅醇、卢一大马士酮、糠醛、正癸醛、己酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、丁二酸二乙酯、2,3一丁二醇、异丙醇、1一己醇。说明不同类型的酶处理对葡萄酒的影响不同,但考虑到游离酶引起芳香味和果香味物质的损失更大,F向于在考虑风味复杂性时要避免不愉快风味的发展,因此建议对“美乐”葡萄酒使用固定化EC降解酶进行处理。
此外,不同处理组测得的挥发性风味化合物的组成也有明显不同。表1和图11显示了“美乐”葡萄酒中不同酶处理方式下主要挥发性香气成分(醇、酯类、酸和醛)的变化规律。
南C6化合物、挥发性酚类物质和苯类化合物组成的香气成分在“美乐”葡萄酒中随着酶处理方式的不同而呈现出不同的趋势。酶处理后醇类和醛类占比降低,而酯类和酸类均有所增加,其他类基本保持不变,表明不同的酶处理方式对挥发性香气化合物产生了一定影响。尽管酶处理方式对葡萄酒巾挥发性物质的相对含量没有显著影响,但引起了香气物质种类的减少和香气成分的改变,且游离酶对其不利影响要大于同定化酶。因此,在人们接受风味有所改变的前提下,同定化EC降解酶更适合用于“美乐”葡萄酒。
通过对壳聚糖与戊二醛的交联条件进行优化后发现,以体积分数5%的戊二醛溶液作交联剂,交联反应进行8h时,载体对酶的固定量达到最大。之后对EC降解酶的酶学性质展开分析,得到如下结果:固定化EC降解酶的最适温度是42℃,在此温度下放置24h时相对酶活达60%以上;其最适DH是3.6,在此条件下放置24h的相对酶活大于60%:在体积分数7%~25%乙醇下,酶活均保持在50%以上,说明该固定化酶的乙醇耐受范围广,催化活性高:该酶在重复使用8次后,酶活还保持在50%以上.而且分别在4℃和20℃下贮藏6周后的酶活损失率不足30%币H40%。最后,采用ATPS结合GC-MS检测不同酶处理的“美乐”葡萄酒中含有的EC,得知同定化EC降解酶的EC去除率达30.90%,是游离酶的81.53%。EC降解酶的处理方式对葡萄酒中挥发性物质的相对含量没有显著影响,只是引起了香气物质种类的减少和香气成分的改变,但固定化酶对挥发性风味物质的不利影响远低于游离酶。
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